大菱鲆仔稚鱼发育早期肠道菌群结构形成的影响因素

为研究鱼类发育早期肠道菌群结构的演变过程及影响因素,运用高通量测序技术,分析了处于不同发育阶段的大菱鲆(Scophthalmus maximus)仔稚鱼肠道、受精卵、不同类型的饵料和水源中的菌群结构,以及它们之间的相关性。结果显示,以不同的OTU(Operational Taxonomic Units,可操作分类单元)作为分类依据,发现大菱鲆仔稚鱼的肠道菌群结构在开口摄食后不久已趋于稳定,其优势菌与受精卵所携带的细菌关联较大。并且在大菱鲆仔稚鱼不同的发育时期,这一菌群的结构非常稳固,几乎不受水和饵料中优势细菌的影响而发生改变。乳球菌属的Lactococcus piscium菌株一直是大菱鲆仔稚鱼肠道中的优势菌种,在不同发育时期的优势度高达45%~65%。本研究还发现,大菱鲆仔稚鱼肠道可能对定植的菌种具有选择性,一些水环境和饵料中的非优势菌,如Streptococcus sp.,Pseudomonas sp.,Carnobacterium sp.等细菌也会定植于肠道,成为大菱鲆肠道中的次优势菌。     

大菱鲆(Scophthalmus maximus)四月龄幼鱼雌雄性比及体重差异分析

利用解剖观察和石蜡组织切片法,对37个家系共计4022尾4月龄的大菱鲆幼鱼群体进行雌雄性别的鉴别和统计分析。发现其中雌性1596尾、雄性2426尾,雌雄性比为1:1.52,极显著偏离1:1的理论值(P<0.01)。在家系水平上,37个家系中有19个家系的雌雄性别比例显著偏离1:1 (P<0.05),其余18个家系雌雄性别比例偏离1:1,但不显著(P>0.05),但其中13个家系中雄性个体比例偏高。研究显示,在群体水平上,人工养殖条件下的4月龄大菱鲆已经出现雌雄性比偏离现象。从37个家系中随机选取20个家系(2254尾幼鱼)测量个体体重,利用SPSS 17.0软件进行数据分析。结果显示,4月龄大菱鲆雌雄个体体重无论在群体还是家系水平都表现为差异不显著。此分析结果表明,在大菱鲆选育过程中,在4月龄时进行的以体重为选育指标的选择不会对选育群体的性比偏离造成显著影响。本研究结果为大菱鲆性比偏离机制研究及良种选育工作提供了参考。     

壳寡糖与低聚木糖对大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼生长、体组成和血液生化指标的影响

本研究以初始体重为(15.46±0.06) g的大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼为实验对象,采用2×3双因素实验设计,研究饲料中壳寡糖(Chitosan oligosaccharide,COS)和低聚木糖(Xylo-oligosaccharide,XOS)对大菱鲆幼鱼生长、体组成和血液生化指标的影响。养殖实验在全封闭循环水养殖系统中进行,养殖周期为60 d。9组实验饲料粗蛋白和粗脂肪含量分别为53%和11%;每组饲料随机投喂3桶,每桶30尾鱼。结果显示,饲料中同时添加0.5%的壳寡糖、1.0%的低聚木糖对大菱鲆幼鱼的促生长作用最明显,相对增重率显著提高。饲料中壳寡糖和低聚木糖对大菱鲆幼鱼增重率、特定生长率、饵料系数、蛋白质效率均有显著影响(P<0.05),但对大菱鲆体成分影响不显著(P>0.05);低聚木糖和壳寡糖对大菱鲆幼鱼特定生长率、增重率、全鱼粗脂肪和灰分、血清甘油三酯、溶菌酶以及碱性磷酸酶均存在显著交互作用(P<0.05)。研究表明,低聚木糖和壳寡糖配合使用可以显著提高大菱鲆幼鱼的生长效果,并且可在一定程度上增强其非特异性免疫能力,降低血脂含量。     

大菱鲆心脏细胞系的建立与鉴定

为丰富海水鱼类细胞系的数量,提供更多的基因功能研究及病毒分离、鉴定工具,本研究建立了一种新的细胞系,大菱鲆心脏细胞系(Scophthalmus maximus heart cell line,SMH).该细胞系使用组织块法(tissue block method)启动原代培养,培养液是添加了胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、人类碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、抗生素、β-巯基乙醇(2-mercaptoethanol,2-ME)、hepes(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)的DMEM/F 12.结果显示,SMH形态呈典型的成纤维细胞样,在培养液中生长分裂旺盛,经230 d传代培养,成功传至58代.用带有绿色荧光蛋白(green fluores-cent protein,GFP)的pEGFP-N3质粒转染SMH,发现GFP在细胞中成功表达,转染效率为40％左右.使用遗传霉素(geneticin,G418)对重组质粒细胞进行筛选,得到了一簇荧光表达效率高的细胞.染色体分析表明,具有正常二倍体核型(2n=44)的细胞占64％.线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome oxidase sub-unit Ⅰ,CO Ⅰ)基因鉴定出该细胞系来源于大菱鲆.该细胞系的建立为大菱鲆功能基因及其他基于细胞系的研究奠定了基础,对大菱鲆的病毒感染途径和分子机制研究具有重要的理论意义.     

恩诺沙星在大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)体内的残留消除规律

本研究比较了在20℃水温条件下恩诺沙星(Enrofloxacin)在3种主要养殖鲆鲽鱼[大菱鲆(Scophthalmus maximus)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)和半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)]体内的残留消除规律。选择体重为300–400 g 的健康2龄大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎,以10 mg/kg 的剂量连续3 d 通过灌胃的方式分别给予恩诺沙星后,于1、3、6、10、15、20、25、30、35、40 d 采集血浆、肝、鳃、肌肉和肾组织。利用高效液相色谱法检测血浆和各组织中的恩诺沙星浓度,拟合恩诺沙星在3种鲆鲽鱼体内的消除曲线,计算消除半衰期。结果显示,3种鲆鲽鱼的组织中,恩诺沙星在肾中残留浓度最高,其消除速度依次为牙鲆>大菱鲆>半滑舌鳎,其消除半衰期分别为3.75、6.54、7.37 d;恩诺沙星在大菱鲆、牙鲆和半滑舌鳎血浆中的消除比其代谢产物环丙沙星慢;综合比较恩诺沙星在3种鲆鲽鱼血浆和大多数组织中的消除规律,均呈现出牙鲆体内消除最快,大菱鲆次之,半滑舌鳎最慢的趋势。依据我国无公害水产品中恩诺沙星最高残留限量为50μg/kg 的标准,建议在20℃水温条件下使用恩诺沙星防治鲆鲽鱼细菌性疾病时的休药期为：大菱鲆44 d、牙鲆33 d、半滑舌鳎47 d 以上。     

Edwardsiellosis in farmed turbot,Scophthalmus maximus (L.), associated with an unusual variant of Edwardsiella tarda: a clinical,aetiological and histopathological study

During 2005 and 2010, a survey of edwardsiellosis on eight turbot, Scophthalmus maximus (L.), farms was conducted in China. This report presents the detailed results of the study on this disease. Diseased turbot displayed two distinct types of gross signs: black discoloration of the dorsal skin on the posterior portion of the body; and red cutaneous foci on the ventral side. Internally, the most pronounced clinical signs in all fish examined were enlarged kidneys. The causal agent of the disease was finally proved to be one species of bacterium that was identified as Edwardsiella tarda by physiological and biochemical tests, API 32E and 16S ribosomal RNA sequence analysis. It is noteworthy that unlike the commonly described E. tarda strains, the isolates in this study were non‐motile strains without flagella. A histopathological study revealed that E. tarda infection was systemic in turbot and that kidney showed the most significant pathological changes, including acute focal necrosis, an influx of macrophages and formation of granuloma. The most common histopathological characteristics of this disease are the proliferation of macrophage in various organs and formation of granuloma. In addition, this article also gave background information on the disease and presented the results of virulence tests with the E. tarda strain identified in this study.     

红鱼粉饲料中添加海洋红酵母对大菱鲆生长性能的影响

为研究用红鱼粉替代白鱼粉,并在替代饲料中添加两个不同梯度海洋红酵母对大菱鲆生长性能、体成分以及形体指标的影响。试验用白鱼粉、红鱼粉、海洋红酵母1 g／kg＋红鱼粉、海洋红酵母2 g／kg＋红鱼粉4种等氮等能的试验饲料分别饲喂初始体质量（213．48±0．23） g的大菱鲆,480尾试验鱼随机分为4组,每组设3个重复,每个重复40尾,试验期为6周。试验结果表明,与红鱼粉组相比,海洋红酵母1 g／kg＋红鱼粉组可显著提高大菱鲆的摄食率、相对质量增加率、特定生长率及蛋白质效率（P＜0．05）,效果与白鱼粉组相当,高于海洋红酵母2 g／kg＋红鱼粉组,但差异不显著（P＞0．05）。各试验组大菱鲆的体成分和形体指标差异不显著（ P＞0．05）。据此,添加海洋红酵母1 g／kg即能显著提高大菱鲆对红鱼粉替代白鱼粉饲料的摄食率、蛋白效率和生长性能,使得红鱼粉替代组的饲料性能达到了白鱼粉组的生长水平。     

皂角苷对大菱鲆血细胞的溶血作用

通过显微观察初步测定了不同浓度皂角苷(2.5、5、12.5、25、50、125 mg/L)融解大菱鲆红细胞的时间及其对白细胞的裂解作用;比较了4℃与20℃条件下,不同浓度皂角苷(2.5、5、12.5、25、50 mg/L)在体外对大菱鲆血细胞的溶血活性;用不同浓度的皂角苷溶液浸浴大菱鲆,得出皂角苷对大菱鲆的半致死浓度;同时分析了不同浓度皂角苷(0、5、25、45 mg/L)浸泡大菱鲆后血液中乳酸脱氢酶(LDH)活力变化。结果显示,显微观察实验中红细胞溶血时间与皂角苷浓度呈对数负相关(R2=0.982 5),皂角苷对大菱鲆白细胞也具有细胞裂解作用;50mg/L的皂角苷在20℃条件下5 min即可导致血细胞100%溶血,而4℃时处理相同时间仅为42.2%;皂角苷对大菱鲆的24 h半致死浓度(24h LC50)为64.85 mg/L。本研究的结果从细胞水平上初步评价了皂角苷的溶血毒性,为其安全使用提供了理论支持。     

大菱鲆选育家系抗鳗弧菌性能

基于家系选育技术开展了大菱鲆(Scophthalmus maximus)抗鳗弧菌病选育研究, 从2010年构建的37个选育二代家系中选择成活率高的30个家系进行鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染实验, 开展对鳗弧菌的抗病性研究。结果表明, 不同家系间抗鳗弧菌感染能力存在着显著差异(P＜0.05); 30个家系中, 鳗弧菌感染后, 12个家系的存活率达到65% 以上, 其余家系的存活率则低于65%; 通过bCOX回归分析, 计算各家系的优势比, 优势比最高的5个家系的存活率达到65% 以上; 对各家系的成活率、优势比和死亡历时差4项指标进行聚类分析, 优势比最高且存活率达到65% 以上的5个家系聚为一类。综合感染家系的高成活率、高优势比以及聚类分析的结果, 选育出5个抗病力较强的优良家系。选育出的抗病力较强的家系可做为抗鳗弧菌选育的核心育种群体, 为抗鳗弧菌病的传代选育奠定良好的基础。

     

迟钝爱德华氏菌黏附及侵袭特性的研究

将引发养殖大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症的病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda（L-49231）接种于体外培养细胞—人上皮角质层形成细胞（HaCaT—cell）,观察其对细胞的黏附性和侵袭性,研究了不同作用时间下以及用不同因素处理菌体后,细菌对HaCaT细胞黏附性及侵袭性的影响。结果表明：L-49231菌株能黏附HaCaT细胞,2h后即可侵入细胞;随着作用时间的延长,细菌黏附细胞与侵入细胞的数量增加。分别用甲醛、戊二醛、盐酸、胰蛋白酶处理L-49231菌体,细菌的黏附力及侵袭力均有所下降;用蔗糖、甘露糖处理L-49231菌体时,细菌的黏附力变化不大;用葡萄糖处理时,能够促进细菌对细胞的黏附作用。用甘露糖和葡萄糖处理菌体时,能促进细菌对细胞的侵袭;用蔗糖处理菌体时,能部分抑制细菌对细胞的侵袭作用。用抗体处理L-49231菌体后,细菌的黏附力及侵袭力均明显下降。说明L-49231菌株对HaCaT细胞具明显的侵袭性,其主要黏附因子为胞外蛋白质成分,无确切的糖受体。